+7 (8452) 34-07-08

410033 г.Саратов, ул.Международная, д.27
схема проезда

РУСENG

Новости

30 Января 2018 г.

«ТехУспех»-2017

Подробнее

07 Сентября 2017 г.

«Биоамид» получит грант от «Сколково»

Подробнее

14 Июня 2016 г.

АО "Биоамид" на Startup Village в Сколково

Подробнее

СОГЛАШЕНИЕ № 14.579.21.0145 от 26.09.2017 г. в рамках Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы"

Уникальный идентификатор  соглашения: RFMEFI57917X0145

Тема: Получение кормового ферментного препарата фитазы на основе рекомбинантного дрожжевого продуцента.

Приоритетное направление: наука о жизни
Исполнитель: Акционерное общество "Биоамид", г. Саратов
Соисполнитель: НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика – Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. Москва
Индустриальный партнер: ООО «Производственное объединение "Сиббиофарм"», г. Бердск

Цель проекта: Разработка высокоактивного рекомбинантного штамма-продуцента кормового фермента фитазы на основе дрожжей Pichia pastoris и масштабируемой технологии ферментации для импортозамещения ферментных кормовых добавок.

Описание проблемы, обоснование актуальности исследований.
Фитиновая кислота и ее соли – фитаты, являются преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах бобовых и масличных растений. Животные с однокамерным желудком не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтеральном тракте животных. В результате не усвоенные фитаты, попадая в почву и водоемы, вызывают загрязнение окружающей среды. Кроме того, фитаты уменьшают доступность белков и микроэлементов в кормах за счет прочного связывания с данными веществами.
Фитаза – фермент, катализирующий гидролиз фитатов с высвобождением инозитола и остатков фосфорной кислоты. В организме животного инозитол подвергается изомеризации до глюкозы и практически полностью всасывается в тонком кишечнике с достаточной энергетической пользой для организма. Соли фосфорной кислоты и органические остатки диссоциируют с образованием ионов металлов и свободных аминокислот. Это означает, что содержащиеся в кормах кальций, железо, марганец, цинк, медь становятся доступнее в среднем на 10-12%. Степень использования самого фосфора растительных кормов повышается на 10% и более (при использовании эффективных фитаз и до 30%) от абсолютной его концентрации в исходном кормовом продукте. Доказано, что попутно с этим, благодаря действию фитазы, повышается доступность метионина в границах 0,38-2,09%, и лизина — в границах 0,76-1,33%. Опосредованно фитазное расщепление растительных соединений фосфора способствуют повышению эффективности использования витамина А, Е и В2.

Согласно исследованию аналитиков мировой рынок фитазы оценивается в 350 млн. долларов США, что составляет почти 50% от стоимости всех кормовых ферментов. При этом процент использования фитазы в животноводстве с каждым годом увеличивается, поскольку экономические преимущества включения данного фермента в рационы нежвачных неоспоримы.
На российский рынок препараты фитаз поставляют более чем 15 производителей, большинство из которых являются зарубежными компаниями, владеющими современными технологиями по всем этапам разработки ферментных препаратов. Российские производители, не могут эффективно конкурировать с ними. Проблема заключается в том, что из-за отсутствия доступных новейших технологий не удается создавать препараты с оптимальными технологическим характеристикам и с конкурентной себестоимостью. Одним из главных компонентов при разработке технологий по созданию современных ферментных препаратов являются промышленные рекомбинантные продуценты нового поколения, синтезирующие ферменты с необходимыми свойствами и, в количествах, обеспечивающих конкурентоспособность производства.
При создании продуцентов в качестве организма-хозяина могут выступать бактерии, дрожжи и грибы. Наиболее перспективными в этом отношении выглядят дрожжи Pichia pastoris, поскольку они не требуют сложных сред для культивирования, способны быстро расти, и кроме того, для них разработана система экспрессии, позволяющая строго контролировать начало синтеза целевого белка с помощью добавления в ростовую среду метанола.

Планируемые работы направлены на получение рекомбинантных дрожжевых продуцентов фитазы и разработку технологии получения целевого фермента для дальнейшего их применения на производственных мощностях индустриального партнера – ООО "ПО «Сиббиофарм».

Основные результаты проекта за 1 этап

Сконструирован вектор для экспрессии генов фитаз в дрожжах P. pastoris. Проведено клонирование генов фитаз из: -Escherichia coli; -Citrobacter freundii; -Obessumbacterium proteus в сконструированном векторе и получены рекомбинантные штаммы дрожжей P. pastoris. Оптимизированы кодоны гетерологичных генов, кодирующих фитазы, с учетом штамма-реципиента. Разработана экспресс методика определения фитазной активности. Разработана технологическая концепция экспериментальной установки для получения ферментного препарата фитазы. Создан модуль лабораторной установки (установка ферментации объёмом 1500 л) для разработки процесса получения фермента фитазы. Синтезированы олигонуклеотиды для амплификации генов фитаз и клонирования, секвенированны генетические конструкции. На первом этапе работы проведен аналитический обзор литературы, касающийся свойств фитаз, необходимых для использования в кормопроизводстве, основных источников генов, кодирующих фитазы различного происхождения и эффективности их экспрессии в дрожжевых системах, а также молекулярно-генетические подходы для создания штамма- продуцента фитазы. На основе литературных данных был обоснован выбор направления исследований, определена актуальность конструирования продуцента фитазы. Проведение патентных исследований позволило заключить, что одним из наиболее актуальных направлений при создании продуцентов ферментов является использование в качестве культуры хозяина дрожжей Pichia pastoris. Данный вид дрожжей успешно используется для экспрессии гетерологичных генов, так как имеет высокую эффективность экспрессии гетерологичных белков, высокую стабильность полученных трансформантов, разработанную систему секреции и достаточно простые условия культивирования. Технология получения ферментов на основе P. pastoris широко применяется в мире, её используют такие компании как ADM, Novozyme и др. Определены возможные варианты конструирования конкурентоспособных рекомбинантных суперпродуцентов фитаз на основе дрожжей Pichia pastories без нарушения действующих патентов. Выбраны оптимальные кодоны гетерологичных генов, кодирующих фитазы, с учетом штамма-реципиента. Сконструирован вектор для экспрессии генов фитаз в дрожжах P. pastoris. Получены рекомбинантные штаммы дрожжей P. pastoris с клонированными генами фитаз из: -Escherichia coli; -Citrobacter freundii; -Obessumbacterium proteus в сконструированном векторе. Синтезированы олигонуклеотиды для амплификации генов фитаз и клонирования, секвенированны генетические конструкции. Разработаны элементы технологии получения ферментного препарата фитазы, а именно технологическая концепция экспериментальной установки для получения ферментного препарата фитазы.

Партнеры